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如何进行染色质免疫共沉淀(ChIP)实验?

人阅读 发布时间:2016-09-07 12:26

    染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用最为主要的方法之一。本实验的原理是在活细胞状态下通过化学交联剂将蛋白质-DNA复合物固定,并将其随机打断成一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学的方法沉淀出目的蛋白质-DNA复合体,从而特异性地富集与目的蛋白相结合的DNA片段。通过对目的DNA片断的纯化与检测,最终获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫共沉淀技术广泛的应用于表观遗传(组蛋白等)分析,转录因子结合位点分析等蛋白质与DNA结合的实验分析中。随着第二代测序技术的逐步完善和成熟,染色质免疫共沉淀结合第二代高通量测序技术(ChIP-seq)正逐步成为基因调控网络研究中一种非常有效的研究手段。
   ChIP实验步骤多,用到的试剂多,其中任何一个小细节都可能导致实验的失败。西安淳风生物科技有限公司总经理谢士勇博士拥有多年的ChIP操作经验(植物类),现分享一些实验经验,希望对广大科研工作者有所帮助。
   在进行染色质免疫共沉淀实验之前,我们首先需要确定两个问题:1)材料的取样时期和部位,2)需要用到的抗体。对于植物而言,过于老化成熟的组织会让甲醛交联过程难以奏效,应尽量避免使用;而选取幼嫩的组织进行分析,可以使得甲醛充分浸润,提高交联效率,从而提高实验的成功率。抗体的选择主要依据实验目的而定,如果是进行表观遗传修饰的分析,则可以根据实验需要选取H3K4,H3K27等抗体;如果是分析转录因子的结合位点,则需要用到转录因子自身的特异性抗体或者与转录因子融合的标签抗体(如HA,Flag,GFP等)。
   实验材料的交联处理:1)为防止样品在交联过程中漂浮起来,可以用尼龙布或纱布将样品包好,或者用其他策略确保样品在交联过程中完全浸润在交联液中。 2)交联的时间是实验成败的关键因素之一,交联时间太短,则交联不够充分,难以沉淀到目的片段,交联时间太长,则容易产生过高的背景噪音。因此针对不同的实验条件和组织材料,实验人员应对交联的时间进行摸索和调整。一般而言,当交联的材料变得透明为宜。3)真空泵升压的时候,应保持缓慢匀速,避免箱内压力的剧烈变化。
   染色质抽提:1)从该步骤开始抽提染色质需要在低温下操作,防止蛋白降解。 2)离心管可放在万向摇床上抽提,转速调至最高。 3) Extraction buffer 1中含巯基乙醇,配制过程要小心,最好从该步骤开始在通风,人少的实验室操作(通风橱最佳)。 4)本实验中蛋白酶抑制主要是两种:PMSF和Protease inhibitors。其中,PMSF毒性较大,而Protease inhibitors又称鸡尾酒蛋白酶抑制剂,为多种蛋白酶抑制剂混合而成,毒性较小,使用安全。5)过滤样品可以不用漏斗,将Miracloth折叠成漏斗状,置于离心管上。 6)Extraction buffer 1配平时,用蔗糖,Tris-HCl即可,有毒试剂可不加。7)加入Extraction buffer 3重悬后得到的染色质沉淀应为白色或浅绿色,如果为深绿色,说明杂质较多,可以加入1ml Extraction buffer 2重复,直至得到纯净的染色质。 8)由于Extraction buffer 3非常粘稠(蔗糖浓度很高),因此在进行重悬的时候会比较困难,但是应小心避免产生气泡,少量的PMSF同样可以起到去除气泡的作用。
   染色质的超声波片段化: 根据不同的实验目的调整超声的时间,一般而言,进行qPCR检测,片段大小在400-1000bp之间;如果进行高通量测序,则延长超声时间,片段大小在200bp左右。
   染色质前处理和免疫共沉淀: 1)抗体和染色质分别与磁珠孵育,最后进行免疫沉淀。这种方法能够有效去除染色质的背景,比抗体和染色质直接孵育效果更好。 2) Protein A/G 需要注意与不同抗体之间的匹配,效价不同,结合能力有差异。
  染色质的预处理:吸取20ul上清作为Input对照,一定不要忘记这一步,否则整个实验没有意义。
  洗脱蛋白质-DNA复合物:通过不同的盐洗脱蛋白质-DNA复合物,需要注意顺序和次数。
  纯化DNA:少量的甘糖原有助于沉淀。做荧光定量PCR时一定注意合适的稀释倍数。
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